Ngày đăng: 24/07/2021, 22:56. BÀI 2: CHIẾT XUẤT STRYCHNIN TỪ HẠT MÃ TIỀN Mục tiêu: - Trình bày đặc điểm nguyên liệu sản phẩm - Thực kỹ thuật: chuẩn bị nguyên liệu, chiết suất, tinh chế, thu sản phẩm cuối Strychnin sulfat - Trình bày giải thích quy trình sản xuất - Viết báo Là một trong những hoạt chất nổi tiếng từ lâu đời trong nền y học bởi những tác dụng sinh học rất mạnh mẽ, Strychnine Sulfate đang là một trong những hoạt chất rất được các nhà khoa học quan tâm. Mời bạn cùng chúng tôi tìm hiểu ngay về hoạt chất này: Nguồn gốc, tác dụng, ứng dụng và ngộ độc Strychnine Nhận định chung. Strychnin là một alkaloid được chiết suất từ cây mã tiền (Strychnos nuxvomica) thường thấy ở khu vực châu Á và Châu Úc. Trước đây từng được sử dụng trong các loại thuốc điều trị rối loạn tiêu hóa, nhược cơ, yếu cơ thắt, đái dầm. Tuy nhiên hiện Nghiên cứu định lượng strychnin và brucin bằng phương pháp HPLC trong alkaloid tổng chiết từ hạt mã tiền (2018) WORD VERSION | 2018 EDITION ORDER NOW / CHUYỂN GIAO QUA Terms in this set (7) chiết xuất alkaloid từ hạt mã tiền. -cân 0,5g bột mã tiền => cho vào bình nón 100ml => thêm 15mldd H2SO4 1N => đun đến sôi ,để nguội => lọc vào bình gạn 250ml => kiềm hóa dịch lọc = NH3 6N (8ml) đến phản ứng kiềm (thử = giấy quỳ) Chiết alk bằng cloroform (5ml EnaR0F. m BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐAI HOC D ươc HÀ NÔI ĐỖ THỊ HÀ 16. ý o p c 1'í' Tff .\ IH Ư -V IE S lĩ-c n k NGHIÊN CỨU CHIẾT STRYCHNIN SULFAT BANG ETHANOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩK H O Ả 2000 - 2005 - Ngưòi hướng dẫn PGS. TS. Đỗ Hữu Nghị - Nơi thực hiện Bộ môn Công nghiệp dược Trường ĐH Dược Hà Nội - Thòi gian thực hiện Tháng 02 - 05/2005 HÀ NỘI, 05 - 200p f . rtt w & Ị v_ M \U - Á LỜI CẢM ƠN Trong 3 tháng thực hiện khoá luận, vói sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo và các bạn đã giúp tôi hoàn thành tốt khoá luận tốt nghiệp “ Nghiên cứu chiết strychnin sulfat bằng ethanol Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới - PGS. TS. Đỗ Hữu Nghị đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện khoá luận. - Các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghiệp Dược đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực nghiệm. Hà Nội, ngày 28/05/2005. SINH VIÊN Đỗ Thị Hà MỤC LỤC Trang CHÚ GIẢI CHỮVIÊT TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ 01 PHẦN 1 - TỔNG QUAN 02 â y Mã tiền 02 Đặc điểm thực vật 02 Phân bố và sinh thái 03 - Bộ phận dùng và thành phần hoá học 04 n g dụng 05 -Strychnin 06 Công thức hoá học 06 - Tính chất 06 - Định tính, định lượng 08 - Tác dụng dược lý và ứng dụng 08 1 .3 - 09 Các phương pháp chiết xuất alcaloid guyêntắc chung 09 - Các phương pháp tách alcaloid dưới dạng tinh khiết 13 1 .5 - Chiết xuất strychnin từ hạt mã tiền 13 - Phương pháp chiết xuất strychnin ở Việt Nam 13 - Phương pháp chiết xuất strychnin trên thế giói 14 PHẦN 2 - THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 15 - Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm 15 - Nguyên vật liệu 15 2 .1 .2 - 15 Phương pháp thực nghiệm - Kết quả thực nghiệm và nhận xét 22 Định lượng strychnin trong nguyên liệu hạt mã tiền 22 - Chiết xuất strychnin bằng ethanol 25 - Chiết xuất strychnin bằng dầu hoả 34 - Kiểm nghiệm thành phẩm strychnin sulíat 37 PHẦN 3 - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40 3 .1 - Kết luận 40 - Đề xuất 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÚ GIẢI CHỮVIẾT TẮT - Bh Bão hoà - Dd Dung dịch - Dm Dung môi - DĐVN Dươc Điển Viêt Nam ĐẶT VẤN ĐỀ Alcaloid là một nhóm hợp chất thiên nhiên quan trọng về nhiều mặt, đặc biệt trong lĩnh vực y học, chúng cung cấp nhiều loại thuốc có giá trị chữa bệnh cao và độc đáo. Strychnin là một alcaloid được dùng trong điều trị với tác dụng chính là kích thích thần kinh trung ương, mặc dù hiện nay strychnin ít được dùng trong điều trị nhưng lại rất có ý nghĩa trong việc nghiên cứu cách tác dụng của các thuốc chống co giật [6]. Hiện nay ở nước ta, xí nghiệp dược phẩm trung ương II đang chiết strychnin bằng dầu hoả. Dung môi này có ưu điểm là chiết chọn lọc nên dịch chiết rút ra sạch, dễ tinh chế và cho hiệu suất cao. Tuy nhiên do độ tan của strychnin trong dung môi này rất thấp nên phải chiết nóng ở 100°c do đó đòi hỏi phải có thiết bị chuyên dụng nồi hơi, nồi chiết 2 vỏ, đồng thcd dầu hoả là dung môi dễ cháy. Các điều kiện chiết xuất này không phải cơ sở nào cũng đáp ứng được. Trong phương pháp chung để chiết alcaloid thì ngoài chiết alcaloid bằng dung môi hữu cơ không phân cực còn có phương pháp chiết alcaloid bằng các dung môi phân cực nước hoặc các dung môi trộn lẫn vói nước. Ở Việt Nam, ethanol là dung môi rẻ tiền, dễ kiếm. Ethanol có khả năng hoà tan alcaloid ở cả dạng base lẫn dạng muối. Nhược điểm của ethanol là dung môi không chọn lọc với alcaloid, nó hoà tan nhiều tạp chất khác như sắc tố, nhựa làm cho quá trình tinh chế khó khăn. Tuy nhiên hạt mã tiền có thể sử dụng ethanol để chiết vì nó chứa ít tạp sắc tố, nhựa nên không ảnh hưởng đến quá trình tinh chế. Mặt khác độ tan của strychnin trong ethanol rất cao, nên có thể chiết ở nhiệt độ thường. Chúng tôi đặt vấn đề “nghiên cứu chiết strychnin bằng ethanol” và so sánh với phương pháp chiết bằng dầu hoả để có thể thực hiện chiết strychnin từ hạt mã tiền với các thiết bị đơn giản mà vẫn đảm bảo hiệu suất chiết so vói chiết bằng dầu hoả. Mục tiêu của khoá luận là - Nghiên cứu phương pháp chiết xuất strychnin sulíat bằng ethanol, xác định các thông số chiết xuất Độ cồn, nhiệt độ, thời gian. - So sánh hiệu suất chiết xuất strychnin sulíat bằng hai phương pháp chiết xuất vói dm ethanol và dm dầu hoả. 1 PHẦN 1 TỔNG QUAN - Cây Mã Tiền Strychnos nux-vomica L. - Đặc điểm thực vật +Strỵchnos nux - vomica L.\ Cây Mã tiền. Cây gỗ, thân đứng, cao 5 - 12m. v ỏ màu xám có lỗ bì. Cành nhẩn, không có móc, đôi khi có gai ở kẽ lá. Lá mọc đối, gốc tù đầu nhọn, dài 6 - 12m, rộng 3,5 8,5cm, nhẵn và dai, mặt trên xanh bóng có 5 gân hình cung nỗi rõ ở mặt dưới. Cụm hoa hình ngù mọc đối ở đầu cành, có 1 - 2 đôi lá có lông mịn. Hoa nhỏ hình ống, màu trắng hoặc vàng nhạt, có 5 cánh hoa hàn liền thành một ống dài 1 - l,2cm, nhị 5, dính ở phía trên ống tràng. Bầu hình trứng nhẵn. Quả thịt hình cầu, đường kính 3 5cm, vỏ cứng, nhẵn bóng, khi chín màu vàng cam chứa cơm quả màu trắng và 1 - 5 hạt hình đĩa dẹt, đường kính 2 - 2,5cm, dày 4 - 4,5mm, một mặt lồi, một mặt lõm có lông mượt toả đều từ giữa ra màu xám bạc. [4, 6] Mùa hoa tháng 3 - 4 . Mùa quả tháng 5 - 8 . Ngoài cây Mã tiền Strychnos nux-vomica L. ở nước ta còn có một số loài mã tiền dây leo thân gỗ khác ♦ Strychnos vanprukii Craib. = s. quadrangularìs Hill., s. nitida Gagnep. mã tiền cành vuông, dây vuông. Dây leo, thân gỗ, dài 5 - 20m, có móc, xếp từng đôi một, vỏ thân màu nâu. Cành non có 4 cạnh nhẵn. Lá hình mác, mọc đối, màu xanh bóng, dài 7 - 12cm, rộng 2,5 - 5,5cm, gốc thuôn, đầu nhọn, có 3 gân, gân phụ nhiễu tạo thành mạng xít nhau. Cụm hoa hình chuỳ dài 2 - 4cm, mọc ở kẽ lá. Hoa mẫu 5, tràng màu vàng nhạt. Quả thịt hình cầu, đường kính 4 - 5cm, khi chín màu vàng cam có 1 - 6 hạt. [4, 7] ềStrỵchnos ignatii Bergius = s. hainanensỉs Merr et Chun cây đậu gió, dây gió. Dây leo, thân gỗ dài 5 - 20m, dựa vào cây khác bằng móc đơn ở kẽ lá. v ỏ thân màu nâu hoặc xám nhạt, có nhiều lỗ bì. Cành tròn nhẵn. Lá mọc đối, hình trứng hoặc thuôn, dài 6 - 17cm, rộng 3,5 - 7cm, đầu nhọn gốc tròn, hai mặt lá nhẵn có 3 2 gân toả từ gốc. Cụm hoa hình chuỳ mọc ở kẽ lá thường ở những lá đã rụng dài 2 2,5cm, cuống hoa có lông. Hoa mẫu 5, tràng màu trắng hoặc vàng nhạt. Quả hình cầu, đường kính 6 - 20cm, khi chín màu vàng có 4 - 10 hạt, hình elip dẹt mặt lõm mặt lồi, phủ lông dài màu vàng xám, mép hạt có một đường gờ nổi chạy vòng. [4, 7] ♦ Strychnos axilỉaries Coỉebr. Mã tiền hoa nách. Cây nhỏ mọc đứng hoặc leo cao 5 - 20m, cành đen đen có móc đơn ở kẽ lá. Lá có phiến đa dạng hình tròn đến thon, dài 3 - 9cm, không lông trừ lông ở mặt dưới, gân chính 3, cuống dài 2 - lOmm, có lông hoặc không. Xim ở nách lá có lông, cuống hoa ngắn, đài cao lmm, tràng có ống cao 3,5mm, nhị 5, bầu không lông. Quả mọng hình cầu, đường kính 1 - 2cm, khi chín màu đỏ cam, có 1- 2 hạt không lông, đường kính 10 - 12mm. [4,7] +Strychnin umbellata Lour. Merr. Mã tiền hoa tán. Cây nhỡ đứng hoặc leo, không mấu, không gai, cành tròn không lông. Lá có phiến nhỏ, dài 2,5- 8cm, rộng 2 - 4,5cm, không lông, cuống dài 1 - 5mm, không lông. Chuỳ hoa ở nách lá và ngọn cành, dài 3 - 7cm, hoa mẫu 4 - 5 , đài nhỏ, tràng trắng nhỏ, cao 4 - 5mm. Quả hình cầu, đường kính 1 - 2cm, có 1 - 3 hạt hình đồng tiền. [4, 7] iStrychnos cathayensis Merr. Mã tiền Trung Quốc, Mã tiền Cát Hải. Cây nhỡ, leo, mấu từng cặp, cành màu nâu có lông mịn. Phiến lá thon, dài 6 lOcm, rộng 2 - 4cm, mặt trên nhẵn bóng, mặt dưới mờ, có ít lông hay không lông. Có 3 gân từ gốc, cuống có lông mịn. Chuỳ hoa ờ nách lá và ở ngọn cành, cao 3 - 4 cm, trục có lông, hoa mẫu 5, đài nhỏ, tràng trắng nhỏ, cao 4 - 5mm. Quả mọng, tròn, đường kính 1 - 2cm, có 3 - 7 hạt. [4, 7] Y học cổ truyền sử dụng hạt của các loài mã tiền này như hạt của cây Mã tiền Strychnos nux-vomica L., nhưng hàm lượng strychnin trong hạt của cây Mã tiền là cao nhất và là nguồn nguyên liệu chính để chiết xuất strychnin. - Phân bố và sinh thái Chi Strychnos L. có khoảng 150 loài trên thế giới, ở Việt Nam có gần 20 loài, hầu hết là những cây dạng bụi trườn, dây leo gỗ và chỉ có ít loài là cây gỗ trong đó có cây Mã tiền. [6] 3 Cây Mã tiền phân bố tập trung ở vùng nhiệt đới Đông Nam Á và Nam Á bao gồm Ấn Độ, Bangladesh, Srilanca, Bắc Malaysia, Mianma, Thái Lan, Bắc úc, Lào, Camphuchia, Việt Nam. Ở Việt Nam, cây Mã tiền chỉ thấy mọc hoang ở các vùng rừng núi phía nam, nhiều nhất ở Khánh Hoà, Bà rịa-Vũng Tàu, Bình Thuận, Ninh Thuận, Gia Lai và Đắc Lắc. Các loài Mã tiền khác phân bố ở hầu khắc các tỉnh miền núi nước ta Cao Bằng, Lạng Sơn, Hoà Bình, Bắc Giang, Sơn La, Nghệ An, Quảng Trị...đặc biệt có nhiều ở các tỉnh Tây Nguyên, Thuận Hải, Đồng Nai, Kiên Giang, riêng loài strychnos cathayensis Merr. mới gặp ở tỉnh Quảng Trị. [4, 6] Sinh thái Mã Tiền thuộc loại cây nhiệt đới điển hình. Cây thích nghi ở vùng có nhiệt độ trung bình năm 24 - 26°c trở lên. Cây ưa sáng, chịu được khí hậu khô nóng, thường mọc ở rừng thưa, rừng nửa rụng lá hoặc rừng kín thường xanh ở đai thấp, dưới 500 m. Cây ra hoa quả nhiều hàng năm. Cây có khả năng tái sinh cây chồi sau khi bị chặt. Ở các vùng đồi ven biển thuộc tỉnh Khánh Hoà, Đồng Nai...có đến trên 50% là cây chồi. Cây mọc từ hạt phải sau 7 - 1 0 năm mới có hoa quả. [6] - Bộ phận dùng và thành phần hóa học - Bộ phận dùng Hạt, thu hái từ quả chín, đã phơi hoặc sấy khô. Loài Strychnos nux - vomica L. hạt hình đĩa dẹt, hơi dày lên ở mép, một số hạt hơi méo mó, cong không đều, đường kính 1,2 - 2,5cm, dày 0,4 - 0,6cm, hoi bóng, màu xám nhạt đến vàng nhạt. Hạt không mùi, vị rất đắng. [5] - Thành phần hoá học Hạt Mã tiền Strychnos nux - vomica chứa nhiều chất thuộc các nhóm -Acaloid 2-5% Strychnin chiếm gần 50%, còn lại chủ yếu là brucin, còn khoảng 2-3% là các alkaloid phụ khác như a-colubrin, P-colubrin, vomicin, novacin, pseudo strychnin...[4] 4 Strvchnin Rị = Rọ = -H Brucin R , = R 2 = -OCH3 oc-colubrin R , = H; R2 = -OCH3 p-colubrin Rị = OCíỉ3; R2 = -H. Ì a ^ n -cm , Rị = R2 = -0 CH3 R3 = -H N o v a xin =R2 = -H NH Ỵ Ỵ A cr ^ 'o - ^ o Pscudosừychnin Ngoài alcaloid, trong hạt còn có chất béo 4 - 5%, acid igasuric = acid clorogenic, acid loganic, stigmasterin, cycloarteroi và một glycozit là loganin = loganozit Loganin có nhiều trong cơm quả. Trong lá có khoảng 2% và trong vỏ thân trên 8% alkaloid nhưng chủ yếu là brucin. Các loài mã tiền khác hiện nay đang khai thác có tỷ lệ alkaloid toàn phần cũng như tỷ lệ strychnin khác nhau. Hạt mã tiền sử dụng làm thuốc phải chứa không ít hơn 1,2% strychnin tính theo dược liệu khô kiệt. [5] - ứng dụng Hạt mã tiền được dùng trong cả y học cổ truyền và y học hiện đại. 5 Y học cổ truyền sử dụng hạt mã tiền đã qua chế biến gọi là mã tiền chế để chữa tiêu hoá kém, ăn uống không biết ngon, phong thấp nhức mỏi tay chân, bại liệt, liệt nửa người, di chứng bại liệt trẻ em, trị đau dây thần kinh, liệt do rượu, liệt não do có nguồn gốc tuỷ, tiêu khí huyết tích tụ trong bụng. Mã tiền chưa chế thường chỉ dùng ngoài làm thuốc xoa bóp chữa nhức mỏi tay chân do thấp khớp, đau dây thần kinh, sử dụng dạng cồn thuốc, dùng riêng hoặc phối hợp với ô đầu phụ tử. Y học hiện đại Hạt mã tiền là nguyên liệu để chiết xuất strychnin. Strychnin thường dùng dưới dạng muối sulíat hoặc nitrat để chữa tê liệt dây thần kinh, suy nhược cơ năng, liệt dương, dùng làm thuốc kích thích hành tuỷ trong các trường hợp giải phẫu não, giải ngộ độc thuốc ngủ barbituric và làm thuốc bổ đắng kích thích tiêu hoá. [4, 6,7]. - Strychnin Strychnin thường được dùng dưói dạng strychnin sulfat. - Công thức hoá học .H2 C2iH22N20 22. H2S 0 4. 5H2ơ Phân tử lượng 856,93 Tên khoa học Strychnidin_10 on sulíat penta_hydrat. - Tính chất Lý tính Tinh thể hình kim không màu hay bột kết tinh trắng, không mùi, vị rất đắng. Bị mất nước kết tinh ở 100°c. Độ chảy khi khan khoảng 200°c bị phân huỷ. 6 Độ tan lg tan trong 35ml nước, 7ml nước sôi, 81ml ethanol, 26ml ethanol ở 60°c, không tan trong ether, khó tan trong cloroíorm. - Hoá tính ♦ Tính chất chung của alkaloid - Tính base yếu + Tác dụng với các acid tạo muối tương ứng Alcaloid = N + HC1 - ► [Alcaloid = N] . HC1 Muối Hydroclorid + Kết hợp với kim loại nặng Hg,Bi,Pt. •. tạo ra muối phức. - Phản ứng vái thuốc thử chung của alkaloid + Phản ứng tạo tủa Tạo tủa rất ít tan trong nước với các thuốc thử thuốc thử Mayer K2HgI4, thuốc thử Bouchardat iodo - iodid, thuốc thử Dragendorff KB1I4... Phản ứng tạo tủa rất nhạy, cho phép phát hiện có alkaloid trong dược liệu hay không. [4] Tạo tủa ở dạng tinh thể vói dung dịch vàng clorid, dung dịch Platin clorid, dung dịch nước bão hòa acid picric... [4] + Phản ứng tạo màu Ngoài phản ứng tạo màu vói các thuốc thử tạo màu chung của alcaloid như acid sulíuric đậm đặc d =1,84, acid nitric đậm đặc d =1,4, thuốc thử Frohde, thuốc thử Marquis, thuốc thử Mandelin...[4], strychnin còn có phản ứng tạo màu đặc biệt đó là phản ứng OTTO 7 Brucin không cho phản ứng này vì có nhóm - OCH3 khoá phản ứng. - Định tính, định lượng - Định tính Định tính strychnin sulfat theo DĐVNIII Có thể chọn một trong 2 nhóm định tính sau Nhóm 1 B, c và D. Nhóm 2 A và D. A Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của strychnin sulíat chuẩn. B Trong phép thử "tạp chất liên quan" vết chính của dung dịch thử phải giống về vị trí, màu sắc và kích thước so với vết chính của dung dịch đối chiếu. C Hoà tan 50mg chế phẩm trong 5ml nước, thêm 0,1 ml amoniac đậm đặc và chiết bằng 5ml cloroíòrm. Bốc hơi dịch chiết cloroíorm đến cạn trên cách thuỷ. Thêm vào cắn 0,1 ml acid sulíuric đậm đặc và một tinh thể Kali dicromat, xung quang tinh thể có màu tím, màu đỏ, màu vàng khi lắc. D Chế phẩm cho phản ứng của ion sulfat. - Định lượng Theo DĐVNIII. Hoà tan 0,500g chế phẩm trong 25ml acid acetic khan, thêm lm l alhydric acetic. Định lượng bằng dung dịch acid perclorid 0,1N. Xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ đo điện thế hoặc bằng chỉ thị xanh malachit. lml dung dịch acid perclorid 0,1N tương đương với 76,70mg - Tác dụng dược lý và ứng dụng - Tác dụng dược lý Strychnin được hấp thu nhanh qua đường tiêu hoá vào máu cả trong huyết tương và hồng cầu, và nhanh chóng chuyển từ máu vào các mô. Strychnin kích thích tất cả 8 các phần của hệ thần kinh trung ương nhưng kích thích tương đối mạnh hơn trên tế bào vận động, đặc biệt là trên tuỷ sống theo cơ chế Trong synap của hệ thần kinh trung ương có hai loại receptor có chức năng đối lập nhau đó là receptor kích thích và receptor ức chế. Receptor glycin là một trong những loại chính của receptor ức chế và nó bị khoá bởi strychnin. Kết quả là các thông tin được truyền đi mạnh hơn rất nhiều trong cung phản xạ mà bình thường các thông tin này bị khử bởi tác dụng sau sinap của glycin. Strychnin kích thích những khả năng về trí não, làm tăng những cảm nhận về xúc giác, thính giác, vị giác và cơn đau. Strychnin kích thích tim mạch, làm tăng lượng epinephrine từ đó làm tăng huyết áp do sự kích thích trực tiếp của hệ thần kinh giao cảm trên cơ trơn động mạch. Tác dụng này rất có ý nghĩa trong điều trị một số bệnh tim mạn tính, đặc biệt trong bệnh viêm cơ tim. Nó cũng được coi là có ích trong điều tri giảm thị lực do ngộ độc, đặc biệt là ngộ độc nicotin. [6] Strychnin kích thích sự bài tiết nước bọt và dịch vị, tăng tốc độ chuyển của thức ăn sang ruột gây ra sự thèm ăn và giúp dễ tiêu. Tuy nhiên nếu dùng luôn sẽ gây ra biến loạn tiêu hoá, biến loạn co bóp dạ dày. [9] Strychnin liều nhỏ làm chậm mệt mỏi, tiếp theo là giai đoạn ức chế hoạt lực cơ. Strychnin được coi là có ích trong điều trị những bệnh co thắt khác nhau như múa giật, hen, động kinh. - ứng dụng Strychnin thường được dùng dưới dạng muối sulíat hoặc nitrat chữa tê liệt dây thần kinh, suy nhược cơ năng, suy nhược, viêm dây thần kinh do nghiện rượu, say rượu cấp, đái dầm, liệt dương. Sử dụng làm thuốc kích thích hành tuỷ trong các trường hợp giải phẫu não, giải ngộ độc thuốc ngủ barbituric và làm thuốc bổ đắng kích thích tiêu hoá. [4, 7] - Các phương pháp chiết xuất alcaloid - Nguyên tắc chung Trong nhóm các hợp chất tự nhiên do alcaloid là nhóm chất có các đặc trưng lý hoá chung nên để phân lập chúng khỏi các nhóm hợp chất tự nhiên khác Aavonoid, coumarin, glycosid... thì có thể sử dụng một số phương pháp được gọi là các 9 phương pháp chung chiết xuất alcaloid và thu được hỗn hợp alcaloid toàn phần. Từ hỗn hợp alcaloid toàn phần để tách riêng từng alcaloid ta phải dựa vào tính chất riêng của mỗi alcaloid mà có phương pháp thích hợp. sau Alcaloid base dễ tan trong dm hữu cơ, không tan trong nước, ngược lai alcaloid dưới dạng muối không tan trong dm hữu cơ và tan trong nước. [8] Như ta biết alcaloid có thể ở trạng thái rắn strychnin, morphin, codein... và ở trạng thái này trong phân tử thường chứa oxy. Ngoài ra, alcaloid có thể ở dạng lỏng nicotin, spactein,... và ở trạng thái này trong phân tử thường không có chứa oxy. Các alcaloid ở thể lỏng ngoài các phương pháp chung chiết xuất còn có thể chiết tách bằng phương pháp cất kéo hơi nước. Với những alcaloid ở thể rắn người ta sử dụng hai phương pháp chiết xuất chung sau - Phương pháp chiết xuất alcaloid dưới dạng base bằng dm hữu cơ a - Chiết alcaloid base bằng dm hữu cơ không phân cực - Giai đoan 1 Chuẩn bị nguyên liệu Xay thô để tăng khả năng chiết ta phải xay nhỏ dược liệu trước khi chiết nhằm làm tăng bề mặt tiếp xúc giữa hai pha rắn và lỏng đẩy nhanh quá trình khuếch tán. Tuy nhiên nếu ta xay nhỏ dược liệu quá, dm sẽ khó chuyển động qua khối dược liệu và rất khó thu được dịch chiết do đó tuỳ thuộc vào từng loại dược liệu ta có thể xay nhỏ khác nhau để vừa đảm bảo đẩy nhanh quá trình khuếch tán vừa dễ dàng trong rút dịch chiết. Mặt khác nếu xay dược liệu nhỏ quá làm các tế bào bị dập nát nhiều, do đó dịch chiết sẽ kéo theo nhiều tạp chất ảnh hưởng đến quá trình tinh chế. [1] Kiềm hoá Kiềm hoá và làm trương nở nguyên liệu bằng dung dịch kiềm thường dùng CaOH2, NH4OH, Na2C 03... để chuyển alcaloid trong nguyên liệu sang dạng base. - Giai đoan 2 Chiết xuất Dùng dm hữu cơ không phân cực thích hợp, dm này hoà tan các alcaloid base vừa được giải phóng. Ở phòng thí nghiệm thường dùng benzen, cloroíorm, ether hoặc hỗn hợp ether và cloroíorm. Có thể chiết nguội hoặc chiết nóng. [1,4] 10 - Giai đoan 3 Tinh chế Nguyên tắc Chuyển alcaloid nhiều lán từ dm hữu cơ sang dm nước và ngược lại w- -để loại các tạp chất không phải là alcaloid. Cuối cùng bốc hơi dm thu được hỗn hợp alcaloid base tinh khiết - gọi là alcaloid toàn phần Sơ đồ chiết xuất alcaloid dưới dạng base bằng dm hữu c ơ •Ưu điểm - Dịch chiết sạch, dễ tinh chế loại các tạp kèm theo do đó hiệu suất chiết cao. 11 - Dm hữu cơ không phân cực thường có khả năng chiết chọn lọc với các alcaloid base. • Nhược điểm - Dm hữu cơ thường đắt tiền, dễ cháy. - Sử dụng dm hữu cơ đòi hỏi phải có thiết bị kín đ hơi dm, có biện pháp thu hồi dm do đó đầu tư cho thiết bị lớn. • ứng dụng Phương pháp này được dùng phổ biến trong chiết xuất alcaloid, đặc biệt với các dược liệu có nhiều chất nhày, pectin, tinh bột... dễ trương nở trong nước. b - Chiết xuất alcaloid base bằng dm hữu cơ phân cực ịethanol, methanol... Do dm hữu cơ phân cực ethanol, methanol... hoà tan alcaloid ở cả dạng muối và dạng base nên có thể sử dụng để chiết alcaloid dưới dạng base. Tuy nhiên nếu dùng dm phân cực để chiết alcaloid thì tuỳ vào bản chất của dược liệu mà dịch chiết có thể kéo theo nhiều tạp chất hơn so với sử dụng dm hữu cơ không phân cực. Và trong khâu tinh chế không thể chuyển trực tiếp alcaloid base sang dạng muối bằng cách dùng nước acid để chiết alcaloid từ pha dm hữu cơ chiết lỏng/lỏng mà phải cất thu hồi dm trước khi chuyển sang dạng muối và chiết bằng nước hoặc dùng một dm không phân cực chiết nó từ dịch cô đặc sau khi loại dm chiết. - Chiết xuất alcaloid dưới dạng muối muối tự nhiên hoặc muối với acid vô cơ bằng dm nước, nước acid hoặc các dm phân cực khác - Giai đoan 1 Chuẩn bị nguyên liệu Xay thô như phương pháp Sau đó làm ẩm dược liệu cho trương nở bằng nước. - Giai đoan 2 Chiết xuất Dùng dm nước để chiết alcaloid ở dạng muối tự nhiên trong cây hoặc dùng dung dịch acid loãng để chiết alcaloid dưới dạng muối với acid vô cơ tương ứng, hoặc dùng dm là methanol và ethanol để chiết xuất alcaloid dưới dạng muối tự nhiên. - Giai đoan 3 Tinh chế Trong trường hợp chiết bằng nước, từ dịch chiết thô alcaloid base được giải phóng bằng cách thêm kiềm sau đó được chiết bằng một dm hữu cơ không hoà tan 12 trong nước. Tiếp tục tinh chế bằng cách bốc hơi dm và kết tinh lại trong dm hữu cơ hoặc chuyển sang dạng muối kết tinh lại. Trong trường hợp chiết bằng ethanol, dịch chiết ethanol được cô đặc, thêm acid và loại các tạp chất bằng các dm hữu cơ không phân cực, thêm kiềm chuyển alcaloid sang dạng base rồi chiết alcaloid base bằng một dm hữu cơ thích hợp. Bốc hoi dm hữu cơ, kết tinh alcaloid hoặc chuyển sang dạng muối kết tinh lại. • Ưu điểm - Dm rẻ tiền, dễ kiếm. - Thiết bị chiết xuất đơn giản, đầu tư ít. • Nhược điểm - Dịch chiết thường lẫn nhiều tạp do đó khó tinh chế, hiệu suất thấp. - Với những dược liệu có nhiều chất nhầy, pectin, tin nước trương nở, làm tăng độ nhớt do đó khó chiết, khó rút dịch chiết. • ứng dụng Với các dược liệu có ít tạp tan trong nước, trong dung môi phân cực. Các phương pháp chung đã nêu ở trên có kết quả tốt đối vói phần lớn các alcaloid trong dược liệu, nhưng một số alcaloid ở dạng base lại tan nhiều trong nước ephedrin, colchicin... hoặc ở dạng muối ít tan trong nước berberin clorid... tan trong dm hữu cơ resecpin hydroclorid tan trong cloroform thì người ta phải có cách chiết riêng cho thích hợp. - Các phương pháp tách alcaloid dưói dạng tinh khiết Từ hỗn hợp alcaloid toàn phần thu được ở giai đoạn tinh chế để tách riêng từng alcaloid dưới dạng tinh khiết có nhiều phương pháp khác nhau như thăng hoa, cất, giải phóng phân đoạn, kết tinh phân đoạn, sắc ký hấp phụ... Tuỳ vào tính chất của alcaloid cần tách mà lựa chọn phương pháp thích hợp. - Chiết xuất strychnin từ hạt mã tiền - phương pháp chiết xuất strychnin ở Việt Nam - Strychnin đã được chiết xuất công nghiệp từ lâu và phương pháp mà xí nghiệp 2 thực hiện là chiết nóng với dm dầu hoả, dịch chiết sau đó được khuấy với dd H2S04 3% và gạn thu lấy lớp acid, dm đem thu hồi để chiết tiếp mẻ sau. Lớp acid được kiềm hóa bằng dd Na2C 0 3 bão hoà để tạo tủa alcaloid toàn phần. Lọc thu lấy tủa, rồi tiến hành loại brucin bằng cách chuyển sang dạng muối nitrat, strychnin 13 nitrat kết tinh còn brucin nitrat thì ở trong nước cái. Lọc thu lấy tinh thể strychnin nitrat đem tẩy màu bằng than hoạt, sau đó chuyển sang dạng muối sulíat. [2] - Quy trình thực tập trước đây của bộ môn Công nghiệp dược là dùng benzen để chiết xuất tiến hành tương tự như chiết bằng dầu hoả như trên nhưng chiết nguội. [3] - Phương pháp chiết xuất strychnin trên thế giói Quy trình của tác giả p. H. List và cộng sự Các tác giả chiết strychnin base bằng dm hữu cơ phân cực rồi cô thu hồi dm và tách strychnin dưới dạng muối HN03. [10] 14 PHẦN 2 THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ - Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm - Nguyên vật liệu - Nguyên liệu Hạt Mã tiền Strychnos nux -vomica L. đã được phơi khô. - Hoá chất và dm - Ethanol. - Dầu hoả. - Sữa vôi. - Na2C 0 3. - H2S04. - H N 03. - Cloroform. - Và các hoá chất khác HC1, NaOH, acid acetic,.. .• - Trang thiết bị - Dụng cụ chiết nóng. - Bình gạn 500 ml. - Máy quang phổ u v - VIS. - Máy cất thu hồi dm. - Máy siêu âm. - Máy đo góc quay cực. - Tủ sấy. - Các dụng cụ khác Bếp điện, cốc có mỏ, ống đong, bình gạn 125 m l,... - Phương pháp thực nghiệm - Định lượng strychnin trong hạt Mã tiền Bằng phương pháp đo quang theo DĐVNIII. Cân chính xác khoảng 0,4g dược liệu qua rây số 355 vào bình nón nút mài lOOml. Thêm chính xác 20ml cloroíorm và 0,3ml amoniac đậm đặc. Đậy kín bình 15 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LƯƠNG THỊ PHẤN NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI STRYCHNIN VÀ BRUCIN TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LƯƠNG THỊ PHẤN NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI STRYCHNIN VÀ BRUCIN TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn 1. Tiến Vững 2. Thị Thuận Nơi thực hiện 1. Bộ môn Hóa Dược- Trường ĐH Dược Hà Nội 2. Khoa Y Dược, ĐHQGHN HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới Nguyễn Tiến Vững - Viện Pháp y Quốc gia, TS. Nguyễn Thị Thuận giảng viên bộ môn Hóa dược- Trường ĐH Dược Hà Nội và ThS. Vũ Đức Lợikhoa Y Dược, ĐHQGHN, đã hướng dẫn tận tình, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô, các kỹ thuật viên bộ môn hóa dược – Trường Đại học Dược Hà Nội và khoa Dược Trường Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm thực nghiệm tại trường. Xin cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, các phòng ban đã tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận. Cám ơn các thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội đã quan tâm dìu dắt và truyền kiến thức cho tôi trong 5 năm học vừa qua. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn ủng hộ, động viên và khích lệ tôi trong quá trình học tập và làm khóa luận. Hà Nội, tháng 5 năm 2014 Sinh viên Lương Thị Phấn MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………..... 1 Chương 1. TỔNG QUAN………………………………………….. 3 Hợp chất strychnin………………………………………………………... 3 Công thức cấu tạo………………………………………….................... 3 Tính chất……………………………………………………………….. 3 Dược động học…………………………………………………………. 3 Tác dụng……………………………………………………………….. 4 Hợp chất brucin…………………………………………………………… 4 Công thức cấu tạo………………………………………….................... 4 Tính chất……………………………………………………………….. 4 Dược động học…………………………………………………………. 4 Tác dụng……………………………………………………………….. 5 Nguồn gốc của strychnin và brucin……………………………………… 5 Tên khoa học………………………………………………................... 5 Thành phần hóa học………………………………………................... 5 Công dụng của mã tiền……………………………………................... 5 Phương pháp định lượng strychnin và brucin……………...................... 6 Phương pháp HPLC………………………………………………………. 9 Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao………………………………. 9 Nguyên tắc của quá trình sắc ký………………………………………. 10 Các thông số đặc trưng cho quá trình sắc ký…………………………. 10 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký…………………… 10 Ứng dụng của phương pháp HPLC………………………................... 11 Các phương pháp xử lý mẫu huyết tương………………………………. 12 Tủa protein…………………………………………………………….. 12 Chiết lỏng- lỏng……………………………………………................... 12 Chiết pha rắn………………………………………………................... 13 Thẩm định phương pháp định lượng……………………………………. 13 Tính thích hợp hệ thống……………………………………………….. 13 Độ chọn lọc…………………………………………………………….. 13 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính…………………………………... 13 Giới hạn định lượng dưới……………………………………………... 14 Độ đúng…………………………………………………….................... 14 Độ chính xác…………………………………………………………… 14 Hiệu suất chiết…………………………………………………………. 14 Độ ổn định………………………………………………….................... 14 Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 Nguyên vật liệu và thiết bị………………………………………………... 15 Nguyên vật liệu………………………………………………………… 15 Trang thiết bị , dụng cụ……………………………………................... 15 Phương pháp nghiên cứu…………………………………………………. 15 Chuẩn bị các mẫu huyết tương………………………………………... 15 Xác định điều kiện sắc ký………………………………….................... 17 Xây dựng quy trình xử lý mẫu huyết tương………………................... 18 Thẩm định phương pháp phân tích…………………………………… 19 Phương pháp xử lý kết quả……………………………………………. 22 Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN……… 23 Xây dựng phương pháp định lượng strychnin và brucin trong huyết tương bằng HPLC…………………………………........................................... 23 Khảo sát điều kiện HPLC và chuẩn nội của phương pháp................... 23 Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu huyết tương……….................... 26 Thẩm định phương pháp phân tích……………………………………… 28 Độ thích hợp của hệ thống…………………………………………….. 28 Độ đặc hiệu- chọn lọc………………………………………………….. 29 Đường chuẩn- khoảng tuyến tính…………………………………….. 31 Giới hạn định lượng dưới LLOQ……………………………………. 33 Độ đúng- độ chính xác trong ngày và khác ngày…………………….. 34 Hiệu suất chiết…………………………………………………………. 37 Độ ổn định của mẫu huyết tương…………………………................... 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………… 42 1. Kết luận……………………………………………………………………… 42 2. Kiến nghị…………………………………………………………………...... 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………..... 43 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHƯ VIẾT TẮT ACN Acetonitril BR Brucin ESI Ion hóa electrospray Electrospray ionization. GC/MS Sắc ký khí/ detector khối phổ Gas Chromatography/Mass Spectrometry. HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao High Performance Liquid Chromatography. HPLC/DAD Sắc ký lỏng hiệu năng cao/detector diod array High Performance Liquid Chromatography/Diode Array Detection. HPLC/MS Sắc ký lỏng hiệu năng cao/detector khối phổ High Performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometry. HPLC/UV Sắc ký lỏng hiệu năng cao/detector UV High Performance Liquid Chromatography/Ultraviolet. HQC Mẫu kiểm chứng nồng độ cao High quality control. HT Huyết tương IS Chất chuẩn nội Internal standard. LC/MS Sắc ký lỏng/ detector khối phổ Liquid Chromatography/Mass Spectrometry. LLOQ Giới hạn định lượng dưới Lower Limit of Quantification. LQC Mẫu kiểm chứng nồng độ thấp Low Quality Control. MeOH Methanol MQC Mẫu kiểm chứng nồng độ trung bình Middle Quality Control. QC Mẫu kiểm chứng Quality Control. r Hệ số tương quan. RP-HPLC Ngược pha sắc ký lỏng hiệu năng cao Reversed Phase- High Performance Liquid Chromatography. RSD Độ lệch chuẩn tương đối Relative Standard deviation. SKĐ Sắc ký đồ ST Strychnin ULOQ Giới hạn định lượng trên Upper Limit of Quantification. UPLC Sắc ký lỏng siêu hiệu năng Ultra Performance Liquid Chromatography. DANH MỤC CÁC BẢNG Tên Bảng Trang Bảng Danh mục các phương pháp định lượng strychnin và brucin 6 Bảng Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống sắc ký 28 Bảng Sự tương quan giữa nồng độ strychnin trong HT và tỷ lệ 31 đáp ứng pic strychnin/IS Bảng Sự tương quan giữa nồng độ brucin trong HT và tỷ lệ đáp 32 ứng pic brucin/IS Bảng Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới của strychnin 33 LLOQ Bảng Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới của brucin 33 LLOQ Bảng Kết quả khảo sát độ đúng, độ chính xác trong ngày của 34 Strychnin Bảng Kết quả khảo sát độ đúng, độ chính xác trong ngày của 35 brucin Bảng Kết quả khảo sát độ đúng, độ chính xác khác ngày của 36 strychnin Bảng Kết quả khảo sát độ đúng, độ chính xác khác ngày của 36 brucin Bảng Kết quả khảo sát hiệu suất chiết IS 900ng/ml 37 Bảng Kết quả khảo sát hiệu suất chiết ST 38 Bảng Kết quả khảo sát hiệu suất chiết BR 39 Bảng Kết quả nghiên cứu độ ổn định của mẫu HT sau 3 chu kỳ 39 đông-rã Bảng Kết quả nghiên cứu độ ổn định mẫu HT thời gian ngắn 40 Bảng Kết quả ổn định mẫu huyết tương thời gian dài 41 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Tên hình vẽ, đồ thị Trang Hình Phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch ST và BR 1000 ng/ml 23 trong dung môi ACNĐệm pH9 3862. Hình SKĐ với tỷ lệ pha động ACN Đệm pH9 3862. 24 Hình SKĐ dung dịch chuẩn nội ibuprofen trong pha động 25 Hình SKĐ dug dịch chuẩn nội cloramphenicol trong pha động 25 Hình SKĐ dung dịch chuẩn nội cafein trong pha động 25 Hình SKĐ của ST, BR và chuẩn nội đã tủa protein bằng MeOH 26 Hình SKĐ của ST, BR và chuẩn nội đã tủa protein bằng ACN 26 Hình SKĐ của ST, BR và chuẩn nội đã tủa protein bằng acid 27 percloric Hình SKĐ của ST, BR và chuẩn nội đã được chiết lỏng- lỏng bằng 27 chloroform Hình SKĐ của ST, BR và chuẩn nội đã chiết lỏng –lỏng bằng 27 ethylacetat Hình SKĐ mẫu HT trắng 29 Hình SKĐ mẫu HT có IS 29 Hình SKĐ mẫu HT có ST 30 Hình SKĐ mẫu HT có BR 30 Hình SKĐ mẫu HT có ST, BR và IS 30 Hình Đồ thị đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa nồng độ 31 ST trong HT và tỷ lệ diện tích pic ST/IS. Hình Đồ thị đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa nồng độ BR trong HT và tỷ lệ diện tích pic BR/IS. 32 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Mã tiền Semen Strychni là một vị thuốc quý được sử dụng từ lâu trong cả đông y và tây y. Vị thuốc này cũng được đưa vào một số Dược điển của các nước như Dược điển Trung Quốc 1997, Dược điển Nhật 1996, Dược điển Anh 1980….. Mã tiền được chế từ hạt chín phơi hay sấy khô của cây Mã tiền Strychnos nux-vomica. Vị thuốc này đã được y học dân gian Trung Quốc sử dụng hiệu quả trong giảm bớt tình trạng viêm, đau khớp, triệu chứng dị ứng và điều trị các bệnh thần kinh. Tuy nhiên do độc tính của hạt rất cao nên không được phép sử dụng trực tiếp mà phải qua chế biến. Alcaloid được biết đến là thành phần thể hiện hoạt tính sinh học của loài cây này, trong đó strychnin và brucin là hai alcaloid có nhiều nhất trong hạt mã tiền và có ảnh hưởng quan trọng đến tác dụng cũng như độc tính của hạt. Một mặt, Strychnin và brucin có tác dụng giảm đau, chống viêm, chống ung thư, nhưng bên cạnh đó chúng có thể dẫn tới các rối loại vận động, tăng trương lực cơ, tăng hoạt động cảm giác, ở liều cao có thể gây co giật hệ thống thần kinh trung ương và dẫn đến tử vong do liệt hô hấp, liệt cột sống hoặc ngừng tim. Ngoài ra, strychnin còn được sử dụng làm thuốc diệt chuột và một số loài động vật gặm nhấm. Nó cũng được biết đến là một trong những chất đầu tiên được sử dụng để nâng cao hiệu suất trong thể thao. Strychnin tác dụng chọn lọc và đối kháng cạnh tranh với glycin trên receptor glycin ở tủy sống. Liều cao tác động cả lên receptor glycin ở não. Ngộ độc strychnin có thể gây tử vong cho người và động vật. [12][30][23] Brucin cũng là một alcaloid mà từ lâu được sử dụng như một loại thuốc truyền thống để điều trị ung thư biểu mô tế bào gan. Nó còn được chứng minh có hiệu quả giảm đau và chống viêm. Độ độc của brucin thấp hơn strychnin nhưng cũng có thể gây co giật hệ thống thần kinh ngoại biên. Do có độc tính mạnh như vậy nên phạm vi sử dụng hai chất này bị giới hạn đáng kể và được kiểm soát chặt chẽ bởi pháp luật ở nhiều nước 2 trên thế giới. Mặc dù vậy vẫn có những trường hợp ngộ độc strychnin được phát hiện, nguyên nhân có thể do bị nhầm lẫn, đầu độc hoặc tự sát. [41] [35] Đây là hai thành phần có độc tính rất mạnh, chỉ với một liều lượng nhỏ cũng có thể gây nguy hiểm đến tính mạng con người. Do vậy để giúp cho việc chẩn đoán, phát hiện nhanh nguyên nhân gây độc và có biện pháp cấp cứu kịp thời, nâng cao hiệu quả cứu chữa nạn nhân cũng như phục vụ cho công tác pháp y thì đòi hỏi phải có phương pháp phân tích nhanh các mẫu bệnh phẩm. Vì vậy việc xác định hai alcaloid này là vô cùng quan trọng trong giám định độc chất. Trong những năm gần đây, trên thế giới có nhiều phương pháp được đề xuất để xác định strychnin và brucin trong dịch sinh học như HPLC/DAD[14], HPLC/MS[32], LS-ESI-MS[42], HPLC-UV[15], UPLC-MS/MS[41]… Tuy nhiên những phương pháp này chưa phù hợp với tình hình thực tế tại Việt Nam. Xuất phát từ yêu cầu thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu định lượng đồng thời strychnin và brucin trong huyết tương bằng phương pháp HPLC’’ với các mục tiêu sau 1. Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời strychnin và brucin trong huyết tương chuột bằng HPLC. 2. Thẩm định phương pháp định lượng strychnin và brucin vừa xây dựng. 3 CHƯƠNG QUAN Hợp chất strychnin Công thức cấu tạo Công thức phân tử C21H22N2O2 Phân tử lượng 334,41 Tên khoa học 4aR,5aS,8aR,13aS,15aS,15bR-4a,5,5a,7,8,13a,15,15a,15b,16decahydro-2H-4,6-methanoindolo[3,2,1-ij]oxepino[2,3,4-de]pyrrolo[2,3-h]quinoline14-one. Tính chất Là tinh thể không màu hoặc màu trắng, không mùi, vị rất đắng. Nhiệt độ nóng chảy 270°C. Khối lượng riêng 1,36 g/cm3. PH của dung dịch bão hòa 9,5. Độ tan trong nước là 1/6400 g/ml, nước sôi là 1/3100 g/ml, rượu là 1/150 g/ml, chloroform là 1/35 g/ml, benzen là 1/180 g/ml, toluen là 1/200 g/ml, methanol là 1/260 g/ml, glycerol là 1/320 g/ml, rất ít tan trong ether. [33][39][28] Dược động học Strychnin hấp thu nhanh chóng từ đường tiêu hóa, đường hô hấp, đường tiêm và da nguyên vẹn. [28][25] Strychnin dễ dàng được chuyển hóa trong cơ thể, chủ yếu bởi cytochrome P450 2B ở gan, và hầu như không có ảnh hưởng tích lũy. Thời gian bán thải là 10-12 giờ.[28] 4 Một vài phút sau khi uống, strychnin được bài tiết không đổi trong nước tiểu, và chiếm khoảng 5% một liều gây chết trong vòng hơn 6 giờ. Thuốc được thải trừ chủ yếu qua thận và gần như hoàn toàn trong 48 đến 72 giờ. [13][26][28] Tác dụng Đối với thần kinh trung ương và ngoại vi có tác dụng kích thích với liều nhỏ, và tác dụng co giật với liều cao. Làm tăng biên độ và tần số hô hấp, tăng tuần hoàn khi các trung tâm này bị ức chế. Liều độc kích thích mạnh tủy sống làm tăng phản xạ và gây cơn co giật giống như co giật do uốn ván. [10][12] Hợp chất brucin Công thức cấu tạo Công thức phân tử C23H26N2O4 Phân tử lượng 394,46 Tên khoa học 4aR,5aS,8aR,13aS,15aS,15bR-10,11-dimethoxy-4a,5,5a,7,8,13a,15, 15a,15b,16-decahydro-2H-4,6-methanoindolo[3,2,1-ij]oxepino[2,3,4-de]pyrrolo[2,3h]quinoline-14-one. Tính chất Tinh thể nhỏ màu trắng, không mùi, vị cay đắng. pH của dung dịch nước bão hòa 9,5. Nhiệt độ nóng chảy Dạng khan 178°C; dạng hydrat 105°C. Độ tan Trong methanol 1/0,8 g/ml; trong chloroform 1/5 g/ml, trong ethyl acetate 1/25 g/ml; trong glycerol 1/36 g/ml; trong ether 1/187 g/ml; trong nước 1/1320 g/ml; trong nước sôi 1/750 g/ml.[29] Dược động học 5 Thí nghiệm trên chuột cho thấy sau khi uống brucin được hấp thu nhanh Tmax < 0,5h. Sự gia tăng AUC cho thấy tỷ lệ thuận với sự gia tăng liều. Sinh khả dụng đường uống F không thay đổi theo liều. Giá trị Cmax được tính toán là 0,73±0,23 µg/ml.[16][17][27] Tác dụng Brucin có tác dụng tương tự strychnin nhưng yếu hơn. Nó gây liệt dây thần kinh ngoại biên và tạo ra cơn co giật dữ dội. Brucin có thể gây buồn nôn, nôn, phấn khích, co giật và co giật với liều lượng lớn. Ngoài ra brucin còn có tác dụng giảm đau, chống viêm và chống ung thư. [29][40] Nguồn gốc của strychnin và brucin Strychnin và brucin là hai thành phần alcaloid trong hạt Mã tiền có độc tính và tác dụng sinh học mạnh. * Một số đặc điểm của cây Mã tiền Tên khoa học Strychnos nux-vomica L. Thuộc họ Mã tiền Loganiaceae. Thành phần hóa học Trong hạt mã tiền có chứa rất nhiều alcaloid trong đó chủ yếu là strychnin, brucin, kết hợp với acid igasuric acid clorogenic. Những alcaloid khác thường gặp là vomixin, struxin, colubrine α và β. Tỷ lệ alcaloid toàn phần trong mã tiền thay đổi từ 2,5 đến 5,5% , trong đó strychnin chiếm 43-45%. [10] Công dụng của mã tiền Trừ phong thấp, hoạt lạc, thông kinh, giảm đau, dùng trong các bệnh phong thấp hoặc mạn tính. Mạnh gân cốt, dùng trong các trường hợp gân và cơ tê đau, cơ thể suy nhược, đau nhức thần kinh ngoại biên. Khứ phong chỉ kinh, dùng trong các bệnh kinh giản, co quắp, chân tay bị quyết lạnh. Tán ứ, tiêu thũng, dùng trong các bệnh ung độc hoặc chấn thương cơ nhục sưng tấy. [11] 6 Phương pháp định lượng strychnin và brucin Hiện nay trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu định lượng strychnin và brucin trong dịch sinh học cũng như trong dược liệu. Qua tham khảo một số tài liệu, chúng tôi thấy có các phương pháp định lượng như sau Bảng Danh mục các phương pháp định lượng strychnin và brucin STT Tài Mẫu thử liệu 1 14 Phương Cột sắc ký Điều kiện sắc ký pháp Máu HPLC/ ThermoHyper- DAD sil C18 250 phosphat 20 mM pH 3,8 mm ×4,6 mm - Tốc độ dòng 1,0 ml/phút 5µm -Pha động acetonitril trong đệm - Nhiệt độ cột 358°C - Bước sóng phát hiện 254 nm - Thể tích tiêm 100 µl -Chất chuẩn nội Chloroquin -Phương pháp xử lý mẫu chiết lỏng-lỏng 2 32 Dịch HPLC/ chiết từ MS côn trùng Phenomenex -Pha động MeOH 10% acid Luna C18 150 acetic 90% mm×2,0 mm, 5µm -Tốc độ dòng 0,25 ml/phút -Nhiệt độ cột nhiệt độ phòng - Bước sóng phát hiện 254 nm -Thể tích tiêm 10µl 3 43 Bột dược HPLC- Zorbax Bonus -Pha động acetonitril- amoni acetat liệu ESI/MS RP 150 20 mM thay đổi từ 30-70% đến 70- mm×2,1 mm, 5µm 30 % trong 30 phút -Tốc độ dòng 0,2 ml/phút -Nhiệt độ cột 40°C -Bước sóng phát hiện 254 nm 7 -Thể tích tiêm 5µl 4 42 Huyết LC-ESI- Waters tương MS SymmetryTM chuột C18 100 mm×4,6 mm, 5µm -Pha động methanol-amoni format 20mM- acid formic 32680,68, vvv. -Tốc độ dòng 0,4 ml/phút - Nhiệt độ cột 30°C -Thể tích tiêm 10µl -Chất chuẩn nội tacrin -Phương pháp xử lý mẫu chiết lỏng-lỏng. 5 15 Mô HPLC- Kromasil C18 -Pha động 24% acetonitril- 76% chuột UV 250 mm×4,6 đệm hỗn hợp đẳng cực của 0,01 mm, 5µm mol/l natri sulfonat heptan và 0,02 mol/l kali dihydrogen phosphat giá trị pH 2,8 bằng acid phosphoric 10 % -Tốc độ dòng 1,0 ml/phút -Nhiệt độ cột 35°C -Bước sóng phát hiện 264 nm -Chuất chuẩn nội hyperzin A -Phương pháp xử lý mẫu chiết lỏng-lỏng. -Thể tích tiêm 20µl 6 41 Huyết UPLC- BEH C18 50 -Pha động methanol acid formic tương MS/MS mm×2,1 mm 0,1 % 2575, v/v 1,7 µm -Tốc độ dòng 0,25 ml/phút chuột -Nhiệt độ cột 40°C -Thể tích tiêm 2 µl - Chất chuẩn nội moclobemide 8 7 31 Nước LC-MS tiểu Cyanopropyl -Pha động acetonitril và acid acetic 100 mm×4,6 1 % trong nước. mm, 3µm, Chrompack, -Tốc độ dòng 1,0 ml/phút - Thể tích tiêm 50 µl Antwerp, -Chất chuẩn nội nalorphin Belgium -Phương pháp xử lý mẫu chiết lỏng-lỏng. 8 22 Mô GC/MS Silica GC 12,5m×0,2m -Phun chia tiêm 110 m 0,33µm -Khí mang Helium 1ml/phút film thickness -Nhiệt độ phun 250°C -Nhiệt độ giao diện MS 280°C -Nhiệt độ lò 170°C MSD -Chế độ ion hóa EI 70ev -Nhân điện tử 2000 V 9 30 Máu và HPLC- XBridgeTM -Pha động acetonitril và amoni nước tiểu ESI-MRM Shield RP 18 bicarbonat 10mmol/l dung dịch 250 mm×3,0 nước ammoniac được dùng để điều mm 5µm chỉnh pH 10,5. -Tốc độ dòng 0,5 ml/phút -Nhiệt độ 35°C -Bước sóng phát hiện 235 nm -Thể tích tiêm 10µl -Phương pháp xử lý mẫu chiết pha rắn. 10 38 Máu RP- HPLC XTerra TM RP -Pha động 10mM amoni 18 150mm×4,6m bicarbonat điều chỉnh pH 10 với amoni hydroxid/acetonitril 7030, LỜI CẢM onv Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành, biết ơn sâu sắc nhất tới cô Nguyễn Thị Việt Hương, là người trực tiếp hướng dẫn tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô trong bộ môn Công nghiệp Dược, các anh chị kỳ thuật viên đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong thời gian làm thực nghiệm. Nhân dịp này tôi cũng gửi lời cảm ơn tới toàn thể giảng viên, các bộ và các bạn sinh viên Trường ĐH Dược HN lời cảm ơn chân thành vì sự dạy bảo, giúp đỡ, dìu dắt tôi trong 5 năm học tại trường. Cùng nhân dịp này, cho tôi được gửi lời cảm ơn chân thành tới 2 chính phủ Việt Nam - Campuchia đã tạo điều kiện cho tôi được sang học tại Việt Nam và xin kính chúc tình hữu nghị lâu bền Việt Nam - Campuchia mãi mãi xanh tươi, đời đời bền vững. Cuối cùng, cho phép tôi được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới bố mẹ, anh chị em, người thân, bạn bè của tôi luôn quan tâm, chia sẻ và giúp đỡ tôi tận tình. Hà Nội, ngày tháng 05 năm 2011 Sinh viên Sun Than MỤC LỤC Trang Chú giải chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ, đồ thị Đặt vấn đề...................................................................................................................1 Chương 1TÓNG QUAN........................................................................................2 1 . 1 . Cây Mã tiền ....................................................................................................... 2 Đặc điểm thực vật...........................................................................................2 Phân bố và sinh thái....................................................................................... 4 1 .2. Bộ phân dùng - Hạt mã tiề n ........................................................................... 5 Thành phần hóa h ọ c...................................................................................... 5 Định lượng Strychnin trong hạt mã tiền.......................................................6 ứng dụng........................................................................................................ 6 Hoạt chất - Strychnin.......................................................................................7 Công thức hóa học và tính chất.................................................................... 7 Định lượng strychnin trong sản phấm.......................................................... 8 Tác dụng dược lý và ứng dụng..................................................................... 8 Các phương pháp chiết xuất alcaloid........................................................... 9 Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ử u ..................... Nguyên vật liệu, thiết b ị................................................................................ Nguyên liệu................................................................................................. Hóa chất và dung môi................................................................................. Thiết bị và dụng cụ..................................................................................... Nội dung nghiên cứ u................................................................................... Lựa chọn dung môi chiết............................................................................ Lựa chọn số lần chiết....................................................................................... 12 Lựa chọn thời gian chiết.................................................................................. 12 Phương pháp nghiên cứu................................................................................. 12 Phương pháp để lựa chọn dung môi chiết.....................................................12 Phương phâp chiết nóng băng dung môi dầu hỏa.................................. 12 2 Phương pháp chiết bằng dung môi cồn 96 ...........................................14 Lựa chọn số lần chiết xuất........................................................................... 15 Lựa chọn thời gian chiết.............................................................................. 15 CHƯƠNG 3 THỤC NGHIỆM, KÊT QUẢ VÀ BÀN LUẬN........................... 16 .Định lượng Strychnin trong dược liệu............................................................ 16 Lựa chọn dung môi chiết................................................................................ 16 Phương pháp chiết nóng bằng dung môi dầu hỏa.........................................16 Phương pháp chiết nóng bằng dung môi cồn 96"'.........................................19 Lựa chọn số lần chiết........................................................................................ 24 Lựa chọn thời gian chiết................................................................................... 26 KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................28 Tài liệu tham khảo D A N H M Ụ C C Á C K Ý HI ỆU, C Á C VI Ế T T Ắ T d d ............................................................................................... dung dịch DĐVN.................................................................... Dược điển Việt Nam p p ........................................................................................ phương pháp STT............................................................................................ số thứ tự T B ............................................................................................. trung bình DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng Hàm lượng Strychnin trong dược liệu................................................... 16 Bảng Khối lượng sản phẩm ở pp chiết bằng dầu h ỏ a.................................... 19 Hàm lượng Strychnin trong sản phấm của pp chiết bằng dầu hỏa.... 19 Bảng Khối lượng sản phẩm ở pp chiết bằng ethanol 96" .............................20 Hàm lượng Strychnin trong SP của pp chiết bằng ethanol 96"............20 Khối lượng SP tương úng với dung môi của các pp chiết xuất........... 21 Hiệu suất sản phẩm tương ứng với các pp chiết xuất........................... 21 Hàm lượng Strychnin trong sản phẩm thu được ở các pp chiết xuất.. 22 Bảng Khối lượng Strychnin Sulfat ở 5 lần chiết của mẻ nguyên liệu...........24 Bảng Tỷ lệ Strychnin Sulfat ở mỗi lần chiết so với tổng khối lượng..........25 Khối lượng sản phẩm ở mỗi thời gian................................................ 26 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, Đ ồ THỊ Trang Hình. 1 . 1 . Cây mã tiền ở Campuchia tại tỉnh kompot............................................... 2 Hình. Lá cây mã tiề n ............................................................................................3 Hình. Quả mã tiền xanh........................................................................................3 Hlnh. Quả mã tiền chín................................... .....................................................3 Hình. Cơm quả mã tiề n ....................................................................................... 4 Hình. . Hạt quả mã tiền.......................................................................................... 4 Hiệu suất tương ứng với các pp chiết xuất.............................................22 lệ % Strychnin Sulfat của mỗi lần chiết so với tổng khối lượng strychnin Sulfat thu đ ư ợc.................................................................................................... 25 lượng Strychnin sulfat ở mồi thơi gia khác nhau..........................27 Đ Ặ T VẤN ĐÈ Nước Campuchia là một nước nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa Đông Nam Á với điều kiện môi trường tự nhiên thuận lợi tạo nên một thảm thực vật làm thuốc rất đa dạng và phong phú. Người dân đã sử dụng tri thức bản địa đế tự phòng và chữa bênh cho minh và cộng đồng. Cây Sleng Sleng tên gọi theo tiếng campuchia là loại cây thuộc chi Strychnos nux vomica L., thường mọc nhiều ở các vùng rừng núi của Campuchia. Trong Đông y hạt cây này được dùng làm thuốc. Dân Campuchia thưòng dùng hạt mã tiền để chữa bênh như nhức mỏi tay chân, tiêu hóa kém, phong thấp, đau dây thần kinh.... theo phương pháp Y học cổ truyền. Hiện nay ở Việt Nam, vấn đề chiết xuất Strychnin Sulfat từ hạt Mã tiền đã được nghiên cứu và sản xuất. Tuy nhiên ở Campuchia cho đến nay qua tìm hiểu chúng tôi thấy vẫn chưa có tài liệu nào nghiên cứu về vấn đề này. Với mong muốn có thể sử dụng qui trình chiết xuất Strychnin Sulfat từ hạt Mã tiền đem áp dụng vào thực tế sản xuất tại đất nước Campuchia, để góp phần vào việc chữa bệnh cho nhân dân trong cộng đồng các dân tộc Campuchia. Hơn nữa tại Campuchia cây Mã tiền mọc hoang rất nhiều, hạt mã tiền Campuchia cho hàm lượng rất cao, do đó việc khai thác nguồn dược liệu này rất thuận lợi. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu kỹ thuật chiết xuất Strychnin Sulfat từ hạt mã tiền có nguồn gốc từ Camphuchia ” với mục tiêu > Lựa chọn dung môi chiết > Lira • chon • số lần chiết > Lựa chọn thời gian chiết - 2 - CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN Cây Mã Tiền Strychnos nux vomica L. Tên khác Củ chi, Phiên mộc miết, Mác sèn sứ Tày. Co bên kho, Co sét ma Thái, Sleng Cămpuchia. Tên nước ngoài; Nux vomica tree, strychnine tree, poison nut tree, vomiting nut, crow fig Anh. Vomiquier, noix vomique, arbre à noix vomique Pháp. Họ Mã tiền {Loganiaceae. Đặc điểm thực vật của cây Mã tiền [5]. Cây to, thân đứng cao 5 - 12 m. Cành nhẵn, không có móc, đôi khi có gai ở kẽ lá, vỏ màu xám có lỗ bì. Hình. Cây mã tiền ở Campuchia tại tỉnh kompot -3 - Lá mọc đối, hình trứng, đầu nhọn, dài 6 - 12cm, rộng 3,5 8 ,5cm, nhẵn và dai, mặt trên màu lục sẫm bóng, gân lá 3, nổi rõ ở mặt dưới, cuống lá dài 5 - lOcm. Cụm hoa mọc ở đầu cành thành chùy dài 3 - 5cm có 1-2 đôi lá có lông mịn, hoa màu trắng hoặc vàng nhạt, lá đài 5, hàn liền có lông, cánh hoa 5, hàn liền thành Hình, Lá mã tiền một ống dài 1 - l,2cm, nhị 5, đính ở phía trên ống tràng, bầu hình trứng, nhẵn. Quả hình cầu, đường kính 3 - 6 cm, vỏ cứng nhẵn bóng, khi chín màu vàng cam hay vàng đỏ, chứa cơm quả màu trắng và 1 - 5 hạt hình tròn dẹt như chiếc khuy áo to, đưòng kính 2 - 2,5cm, dày 4 - 5mm, một mặt lồi, một mặt lõm, có lông mượt óng ánh tỏa đều từ giữa ra, màu xám. Mùa hoa quả tháng 2 - 8 . Hình. Quả mã tiền xanh Hình. Quả mã tiền chín - 4 - Hình. Com quả mã tiền Hình. Hạt quả mã tiên Phân bố và sinh thái. Chi strychnos L. có khoảng 150 loài trên thế giới, ở Malaysia, có 25 loài PROSEA, No 121 - Medicinal and Poisonos Plant, 1999, 467, Việt Nam có gần 20 loài, hầu hết là những cây dạng bụi trườn, dây leo gỗ và chỉ có ít loài là cây gỗ, trong đó có cây mã tiền. Cây mã tiền phân bố tập trung ở vùng nhiệt đới Đông - Nam Á và Nam Á, bao gồm Ấn Độ, Bangladesh, Srilanca, Mianma, Thái Lan, Campuchia, Lào, Bắc Malaysia, Việt Nam. Cây có mọc hoang nhiều ở các vùng rừng núi Campuchia. ở Việt Nam, mã tiền chỉ thấy ở các tỉnh phía nam, nhiều nhất ở Khánh Hòa, Bình Thuận, Ninh Thuận, Đồng Nai, Bà R4a - Vũng Tàu, Long an, Tây Ninh, Kiên Giang đảo Phú Quốc, Gia Lai và Đắc Lắc. Sinh thái ; Mã tiền thuộc loại cây nhiệt đới điển hình. Cây thích nghi ở vùng có nhiệt độ trung bình là 24 - 26 °c trở lên. Cây ưa sáng, chịu được khí hậu khô nóng, thưòng mọc ở rừng thưa, rừng nửa rụng lá hoặc rừng kín thường xanh ở đai thấp, dưới 500m. Cây ra hoa quả nhiều hàng năm. Cây có khả năng tái sinh cây chồi sau khi bị chặt, ở các vùng đồi ven biển thuộc tỉnh - 5 - Khánh Hòa, Đồng Nai... có đến trên 50% là cây chồi. Cây mọc từ hạt phải sau 7 - 1 0 năm mới có hoa quả [ 4,5 ]. Bộ phân dùng - Hạt mã tiền. Hạt {Semen Strychní, thu hái từ quả chín, đã phơi hoặc sấy khô. Loài Strychnos nux - vomica L hạt hình đĩa dẹt, hơi dày lên ở mép, một số hạt hơi méo mó, cong không đều, đường kính 1,2 - 2,5cm, dày 0,4 - 0,6cm, hơi bóng, màu xám nhạt đến vàng nhạt. Hạt không mùi, vị rất đắng [5]. Thành phần hóa học. Trong hạt mã tiền Strychnos nux vomica L có chứa từ 2 - 5% alcaloid, chủ yếu là strychnin, brucin, ngoài ra có một số các alcaloid khác như a-colubrin, P-colubrin, vomicin..... [ 1, 2 ]. Strychnin Ri = R2 = - H Brucin Ri = R2 = - 0 C H 3 a - colubrin Ri = H , R2 = - 0 CH3 p - colubrin Ri = - 0 CH3 , R2 = H Novaxin R = R2 = - 0 CH3 ; R3 = -H Vomixin R = R2 = - H ; R3 = - OH -6- Định lưọng Strychnin trong hạt mã tiền. Theo DĐVN IV. Cân chính xác khoảng 0,4g dược liệu đã rây qua rây số 355 vào bình nón nút mãi lOOml. Thêm chính xác 20ml chloroform TT, và 0,3ml ammoniac đâm đặc TT. Đậy kín bình và cân. Đun hồi lưu cách thủy trong 3 giờ hoặc 40 phút trong bể siêu âm 350w, 35 kHz. Cân bổ sung lượng chloroform hao hụt. Lắc đều, lọc nhanh vào bình nón. Lấy chính xác 1Oml dịch lọc cho vào bình gạn 50ml . Chiết 4 lần với lOml dd acid sulfuric 0,5M. Lọc dịch acid qua giấy lọc đã thấm ướt bằng dung dịch acid sulfuric 0,5 M vào một bình định mức 50ml. Rửa giấy lọc bằng một lượng đủ dd acid sulfuric 0,5 M, gộp dịch rửa vào bình định mực và them cùng dung môi cho tới vạch, lắc kỹ. Hút chính xác lOml dd này cho vào bình mức 50ml pha loãng vừa đủ bằng dd sulfuric 0,5M TT lắc đều. Xác định độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 262nm và 300nm . Hàm lượng strychnin được tính theo công thức 0/ c . u • _ 50,32k /-0 ,4 6 7 M % Strychnin =-5^^— 7- T-’^ m{\-x a độ hấp thụ ở 262nm, b độ hấp thụ ở 300nm m khối lượng mẫu thử g X độ ẩm của dược liêu g Hàm lượng strychnin C21H22N 7O2 không ít hơn 1,2% tính theo dược liệu khô kiệt. ứng dụng Hạt mã tiền được dùng trong cả y học hiện đại và y học cố truyền . - 7 - Y học cổ truyền sử dụng hạt mã tiền đã qua chế biến để chữa Bệnh tiêu hóa kém, phong thấp, nhức mỏi tay chân, tiêu khí huyết tích tụ trong bụng, đau dây thần kinh, bại liệt, liệt nửa người, chó dại cắn [4, 5]. VD thuốc trị phong thấp Phong Bà Rằng, viên Vimatin trường ĐH Dược Hà Nội. Hoạt chất - Strychnin. Strychnin thường được dùng dưới dạng Strychnin Sulfat. Công thức hóa học và tính chất * Công thức hóa học. .2 * Công thức phân tử C2iH22N 202 4 .5 H2 0 *Tính chất. - Lý tính Tinh thể hình kim, không màu hay bột kết tính trắng, không mùi, vị rất đắng, rất độc. Bị mất nước kết tinh ở 100"c. Độ chảy khi khan khoảng 200“c bị phân thủy. Độ tan Ig tan trong 35ml nước, 7ml nước sôi, 81 ml ethanol, 26ml ethanol ở 60”c , không tan trong ether. Dung dịch 1% có pH= 5,5. - Hóa tính có tính kiềm chung của alcaloid có nitrơ hóa trị 3, có tính kiềm tương tự như NH3, tác dụng với acid tạo muối Alc N + HCL [ Alc = N ]. HCL Muối hydroclorid - 8 - Alcaloid là các base yếu nên chúng dễ dàng bị các base mạnh và trung b ìn h như NaOH, CaOH2, N a2CƠ 3, NaHCƠ3, N H 4 O H đẩy ra k h ỏ i m u ố i của chúng với acid tạo alcaloid base. Tình chất này của alcaloid được ứng dụng để kiềm hóa dược liệu trước khi chiết xuất bằng dung môi hữu cơ không phân cực [ 1, 2 ]. Định lượng strychnin trong sản phấm Theo DĐVN IV. Hòa tan 0,500g chế phẩm trong 25ml acid acetic khan, them Iml alhydric acetic. Định lượng bằng dung dịch acid perclorid 0,1N. Xác định điếm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ đo điện thế hoặc bằng chỉ thị xanh malachite. Iml DD acid perclorid 0,1N tương đương với 76,70mg C2iH22N 202 2H2S0 4 . Tác dụng dưọc lý và ứng dụng. *Tác dụng dược lý [4, 5. Strychnin là chất kích thích tim mạch, hô hấp và chất bổ đắng. Nó kích thích tất cả các phần của hệ thần kinh trung có tác dụng kích thích tương đối mạnh hơn trên tế bào vận động của hệ thần kinh trung ương, đặc biệt trên tủy sống, do tác dụng đối kháng cạnh tranh với chất dẫn truyền ức chế ở những điểm ức chế sau khớp thần kinh. Nó kích thích những khả năng về trí não, làm tăng những cảm nhận về xúc giác, thính giác, khứu giác, vị giác và cơn đau. Strychnin có hiệu lực trong ngộ độc do thuốc mê, thuốc ngủ barbituric, thuốc phiện hoặc cloral. Nó cũng được coi là có ích trong điều trị giảm thị lực do ngộ độc, đặc biệt là ngộ độc nicotin. Strychnin đã được sử dụng rộng rãi như một thuốc làm dễ tiêu thuốc tay. Nó cũng được dùng trong giảm thị lực và làm thuốc kích dục. Strychnin hấp thu nhanh qua đường tiêu hóa vào máu, cả trong huyết tương và hồng - 9 - câu, và nhanh chóng từ máu chuyến vào các mô. Nó bị phá hủy nhanh trong cơ thể, chủ yếu bởi các men và những vi tiểu thể gan, gần 2 0 % lượng alcaloid bài tiết qua nước tiểu. * ứng dụng Strychnin Strychnin thường được dùng dưới dạng Sulfat hoặc nitrat chữa tê liệt dây thần kinh, suy nhược cơ năng, suy nhược, viêm dây thần kinh do nghiên rượu, say rượu cấp, đái dầm, liệt dương. Sử dụng làm thuốc kích thích hành tủy trong các trường hợp giải phẫu não, giải ngộ độc thuốc ngủ Barbituric và làm thuốc bổ đắng kích thích tiêu hóa[4, 5Ị. Các phương pháp chiết xuất alcaloid. * Nguyên tắc chung. Trong nguyên liệu thực vật ngoài alcaloid còn có vô số các chất khác như protein, nhựa, tannin, terpenoid, glycoside, sáp... Chiết xuất các alcaloid là tách chúng ra khỏi dược liệu dưới dạng tính khiết, không lẫn các tạp chất hóa học khác nhau có chứa trong dược liệu. Do các alcaloid có tính chất chung nên chúng có phương pháp chiết chung. Dựa vào tính chất của dung môi chiết có 2 phương pháp sau - Phương pháp chiết alcaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ không phân cực - Phương pháp ch iết alcaloid dưới dạng muối bằng dung môi nước, nước acid hoặc cồn ethanol, methanol.... * Phương pháp chiết xuất Strychnin ở Việt Nam. Strychnin đã được chiết xuất công nghiệp từ lâu và phương pháp mà xí nghiệp 2 thực hiện là chiết nóng với dm dầu hỏa, dịch chiết sau đó được khuấy với dd H2SO4 1% và gạn thu lấy lớp nước acid, dm đem thu hồi đe chiết tiếp mẻ sau. Lớp nước acid được kiềm hóa bằng Na2C0 3 bão hòa để tạo tủa alcaloid toàn phần, lọc thu lấy tủa, rồi tiến hành loại brucin bằng cách - 10 - chuyển sang dạng muối nitrat, Strychnin nitrat kết tinh còn brucin nitrat thì ở trong nước cái. Lọc thu lấy tinh thể Strychnin nitrat đem tẩy màu bằng than hoạt, sau đó chuyển sang dạng muối Sulfat [2 ]. - 11 - CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGUYÊN cứu Nguyên vật liệu, thiết bị Nguyên liệu Hạt Mã tiền Strychnos rĩux vomica L thu hái ở rừng núi gần Thị xã Chum KiRy, tỉnh KamPot, Campuchia vào tháng 03 năm 2011. Hàm lượng strychnin trong hạt mã tiền là 2 ,0 1 %. Hóa chất và dung môi. - Vôi bột pha thành sữa vôi Ethanol 96" - dd Na2CƠ 3 bão hóa ClorofonTi - dd H2SO4 0,5 % , H2SO4 3% Amoniac đậm đặc - dd H N O 3 3 % Acid acetic khan - Than hoạt anhydrid acetic - Dầu hỏa dd acid percloric Trang thiết bị. uv - - Hệ thống thiết bị chiết nóng - Máy quang phổ - Máy xay - Máy siêu âm - Tủ sấy - Máy cất quay BƯCHI - Bơm chân không VIS Rotavapor R-200 Thụy Sỳ Nội dụng nghiên cứu Lựa chọn dung môi chiết Đe lựa chọn dung môi chiết xuất, chúng tôi tiến hành khảo sát 2 phương pháp chiết tương ứng với 2 dung môi khác nhau - pp 1 dung môi là dầu hỏa - pp 2 dung môi là ethanol 96” - 12 - Đánh giá ưu nhược điểm của từng phương pháp trên hiệu quả chiết xuất, chất lượng sản phẩm, khả năng ứng dụng trong thực tế. Từ đó lựa chọn phương pháp ứng với dung môi chiết xuất tổi ưu. Lựa chọn số lần chiết. Chiết Strychnin Sulfat nhiều lần bằng dung môi đã chọn, dựa vào tỷ lệ khối lượng sản phấm thu được ở mỗi lần chiết để lựa chọn số lần chiết thích hợp. Lựa chọn thời gian chiết xuất Chiết Strychnin Sulfat theo các khoảng thời gian khác nhau với dung môi đã chọn, dựa vào khối lượng sản phẩm thu được ở mỗi thời gian chiết để lựa chọn thời gian chiết thích hợp. Phu’ong pháp nghiên cứu Phương pháp để lựa chọn dung môi chiết Theo nguyên tắc chung, chúng tôi đã thử chiết Strychnin từ hạt mã tiền theo cả 2 phương pháp với 2 loại dung môi khác nhau. - Phương pháp 1. Chiết bằng dung môi phân cực cồn ethanol 96". - Phương pháp 2. Chiết bằng dung môi không phân cực Dầu hỏa. Tiến hành chiết các mẻ dược liệu trong các điều kiện giống hết nhau, chỉ thay đổi dung môi chiết. Dựa vào khối lưọng Strychnin Sulfat thu được để lựa chọn dung môi thích hợp. Phưong pháp chiết nóng bằng dung môi dầu hỏa. Hạt mã tiền sau khi đã kiểm nghiệm đạt tiêu chuẩn về hàm lượng, chúng tôi tiến hành chiết xuất bằng dung môi dầu hỏa theo sơ đồ sau - 13- - 14- Phương pháp chiết xuất bằng dung môi cồn 96". Nghiên cứu định lượng strychnin và brucin bằng phương pháp HPLC trong alkaloid tổng chiết từ hạt mãPublished on Jan 14, 2020About"Nghiên cứu định lượng strychnin và brucin bằng phương pháp HPLC trong alkaloid tổng chiết từ hạt mã tiền 2018"

định lượng strychnin trong hạt mã tiền